慶應三年（１８６７年）十二月九日，以薩摩和長州為首的倒幕派仿傚了八一八政變的做法，佔據了京都御所，將親幕派公卿擋在宮門外；倒幕派在小御所內討論國是，頒下了王政復古大號令，廢除了將軍職位和一切幕府制度，新設總裁、議定、參與三職。德川慶喜雖然已經失去將軍職位和領地，但支持幕府的人仍然不少，是倒幕派的心腹大患，不過德川慶喜不願與新政府衝突，便帶領會津、桑名藩兵以及新選組一同退守大坂，不久新選組返回京都，以伏見奉行所為屯所，繼續維持治安。
十二月十八日，剛好是油小路事件一個月。這一天近藤勇前往二條城參與會議，下午乘馬回程時在伏見街道遭遇富山彌兵衛等御陵衛士餘黨的伏擊，近藤勇右肩中槍受傷，但性命無大礙。事後他與患上肺結核的沖田總司一起到大坂接受治療，新選組隊務則交由副長土方歲三處理。
三日後的二十一日夜晚，新選組繼續在京都市中巡邏，路上遇上薩摩藩兵，雙方爆發衝突，直到翌日天亮，在附近的尾張藩邸趕緊調停，才不致發生傷亡。
不過當時的政治形勢十分緊張，新政府和舊幕府的戰爭已到了一觸即發的地步。薩摩藩西鄉隆盛僱用一群浪人，在江戶市內縱火；舊幕府不能再忍受薩摩藩接二連三的挑釁，於是發布了「討薩表」，正式向新政府軍宣戰。
慶應四年（１８６８年）正月二日，屯駐在大坂的舊幕府軍向京都進發。翌日早上，舊幕府軍在鳥羽街道遇上守備的薩摩藩兵，雙方對峙；另一方面，會津藩兵抵達京都伏見，與新選組合流。下午五時，對峙形勢升溫，鳥羽街道的薩摩藩兵向舊幕府軍發砲，同一時間伏見御香宮的薩摩藩兵亦向奉行所發砲，鳥羽伏見之戰正式展開。
伏見御香宮的薩摩藩兵，對奉行所不停砲擊，燒著奉行所和附近民居；永倉新八帶隊嘗試突圍，但不成功，會津藩幾個勇猛的藩兵帶頭攻擊，也未能衝破敵陣。直到深夜，舊幕府軍撤退到淀城。
正月四日及五日，新選組及會津藩兵在千兩松一帶與新政府軍激戰，新選組六番隊隊長井上源三郎陣亡，伍長近藤芳助受傷。遊擊隊（幕府旗下一支武裝隊伍）隊員堤金三郎當時也在交戰現場，他事後記錄所見所聞：「新選組三名士兵，在堤上發射大砲擊中敵軍，敵軍火力猛烈的時候則躲在堤下，但其中一名中了流彈，貫穿了腹部‥‥‥」（《徒然叢書》）近藤芳助在明治年間寫了回憶錄《新選組往事實戰譚書》，亦記述這一戰持續了好幾個小時，新選組和會津藩死傷眾多。
舊幕府軍抵擋不住新政府軍猛烈攻勢，他們且戰且退，放火阻止新政府軍前進，並打算退入淀城重整軍勢，但這時候新政府軍亮出了錦御旗，等於宣告舊幕府軍是朝廷敵人！淀城稻葉正邦本來是幕府老中，理應援助舊幕府軍，但他看到了對方的錦御旗，不想與朝廷為敵，便拒絕讓舊幕府軍入城。
正月五日深夜，舊幕府軍越過淀川，退守淀城南方的男山，那裡有幕末安政年間建造的炮台，舊幕府軍就在那裡展開陣勢，土方歲三率領新選組在男山西翼橋本列陣，男山南方則有小濱藩兵。新政府軍則佔領淀川對岸高濱炮台與舊幕府軍對峙。高濱炮台附近有津藩藩兵列陣，津藩藩主藤堂高猷（有一說是藤堂平助的親生父親）是佐幕派，但當晚津藩藩兵接受新政府軍招降，臨陣倒戈，舊幕府軍失去一支強力的援軍，再也無心戀戰。第二天（正月六日）在新政府軍猛烈攻擊之下，舊幕府軍往大坂城撤退。這一役，新選組損失了四名隊員。
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| 鳥羽伏見之戰繪畫 （圖片來源：http://boshin.city.aizuwakamatsu.fukushima.jp/history-details/645/） |
當晚德川慶喜竟然帶著會津藩主松平容保、桑名藩主松平定敬（松平容保之弟）以及數及重臣乘坐軍艦開陽丸悄悄離開大坂城，遺下新選組和多數幕兵在城內。當這些舊幕府軍知道主君不在城內已經太晚，紛紛作鳥獸散。新選組則獲通知返回江戶集合。正月九日，新選組所有能行動的人都乘坐順動丸離開大坂，十二日抵達江戶品川。
抵達江戶第二天（正月十三日），近藤勇和土方歲三一同登城，佐倉藩士依田學海向他們詢問京都的戰況，土方歲三回答說：「作戰沒有大砲不可，我佩劍執槍，亦一無所用。」以往新選組取締不法浪士，憑一柄刀劍與無數武術超群之輩交手，亦所向披靡，但說到上戰場，刀光劍影又如何勝得過槍林彈雨？
新選組面臨的是實實在在的戰爭，需要裝備先進的武器衝鋒陷陣。土方歲三購入了五鋌新式火槍，雖然數目不大，但是可以看到新選組適應近代戰爭需要的決心。
二月十二日，在新政府東征軍尚未抵達江戶的時候，德川慶喜率先從江戶前往上野寬永寺，表示恭順新政府的心意。近藤勇分配隊員在江戶到上野沿途戒備。三日後，新選組正式接到守備寬永寺的任務，近藤勇將隊員分成兩組，輪番守衛寺院。
不多時，舊幕府取消了新選組守衛上野寬永寺的任務，調派新選組前往甲府。據說德川慶喜臨行之前，將交涉大權委託給勝海舟，而勝海舟不欲主戰派的新選組阻礙與新政府的談判，所以將新選組調離江戶。
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