尊攘志士的擁護對象孝明天皇，反而對尊王攘夷派的專橫做法深感不滿，現在他身邊的公卿多數都是長州派的夥伴，志士在外殘殺異己，公卿在內擅改聖旨，天皇早已淪為提線木偶。天皇最信任的會津藩主（京都守護職）松平容保，打算「清君側」，驅除天皇身邊的惡人，他暗地裡聯合同樣在政治上失勢的薩摩藩，策劃一場驚天動地的大政變。
根據他們的計劃，在八月十七日御前會議完結、公卿離去之後，會津、薩摩及其他各藩藩兵據守各個宮門，解除長州藩守衛宮門的職務，並禁止攘夷派公卿進入。會津藩負責防禦蛤御門，他們命令壬生浪士組參與行動，這是壬生浪士組成立以來第一次正式行動。
芹澤鴨、近藤勇、新見錦三名局長率領八十名隊士，穿著新訂製的淺藍色制服，舉著六尺的「誠」字大旗，浩浩蕩蕩前往蛤御門待命。蛤御門的守衛沒見過壬生浪士組，當即舉起長槍攔住他們，要他們報上名來；芹澤鴨用他的招牌大鐵扇將長槍撥開，喝罵士兵不得無禮，經過會津藩軍事奉行西鄉十郎右衛門調停後，才化解了雙方誤會。
壬生浪士組在這一天開始使用「新選組」的名稱。根據隊士島田魁的日記寫道：「文久三年（１８６３年）八月十八日，長州人退治之際，當組負責守衛南門，傳奏頒下了『新選組』這個隊名。」這名稱不是壬生浪士組或者會津藩自己命名，而是由公卿傳奏（武士不能直接與天皇見面或說話，必須經由特定公卿代為傳達）。命名的原委並不清楚，可能是指新挑選出來的團隊，亦有一種說法是會津藩原本就有同一名稱的組織，是藩主身邊的親衛隊。無論如何，「新選組」從此成為壬生浪士組的官方名稱。
順帶一提，我們常常在書籍或映畫裡看到「新選組」和「新撰組」兩個名稱，它們固然是指同一個團體，可是會出現兩個不同的名稱？因為在日文中「選」和「撰」是同音字，意思都是「選擇」、「挑選」，只是寫法不同而已。會津藩的公文記錄多數使用「撰」字，永倉新八晚年所寫的《新撰組顛末記》，也多用「撰」字，近藤勇自己則兩個字混合使用。用「選」或者用「撰」，並沒有所謂正確與否，純粹是個人使用習慣問題。
言歸正傳，八一八政變當日，新選組奉命守衛仙洞御所（上皇居住的地方，在天皇御所的東南面），他們全副武裝，摩拳擦掌，等待與長州藩的交鋒，但長州藩和攘夷派公卿在御所南面的堺町門遭遇，一眾高手沒有用武之地。幕末歷史上最重要的一天，就這樣和他們擦身而過。
退去了外敵之後，輪到清算自己人的時候。第三章提到芹澤鴨的惡行，給京都市民極壞的印象；會津藩身為京都守護職，負有維持治安的責任，不能對芹澤鴨的行為視若無睹。在島原事件和力士事件之後，芹澤鴨不但沒有收歛，反而變本加厲。八一八政變之前，攘夷團體「天誅組」在京畿各處勒索商人，強迫他們出錢資助，對於不肯從命的商人，則強加與夷人通商謀利的罪名，把他們殺害，梟首示眾；京都葭屋町一個叫大和屋庄兵衛的生糸批發商，因為將生糸大批賣給外國商人而獲厚利，不幸被天誅組點名，連忙託人送上一萬兩金換取平安。這麼重大的治安事件，芹澤鴨自然知道，他非但不捉拿肇事兇徒，反過來找上大和屋庄兵衛，乘機敲詐他一筆。
八月十三日——政變之前五天。芹澤鴨到訪大和屋，要求大和屋交錢出來，他說你們有錢資助天誅組，也一定有錢資助新選組吧，但大和屋庄兵衛剛巧不在，留守的人不敢答應；芹澤鴨大怒，當晚帶著幾名部下，拖著大炮，炮轟大和屋的倉庫，倉庫馬上陷入火海，燒到天亮仍未熄滅，市內消防隊前來滅火，芹澤鴨卻命令部下舉槍指嚇消防員阻止他們靠近。芹澤鴨登上附近民居的屋頂，看著熊熊烈火樂不可支，直到下午才離去，期間竟然沒有任何警察部隊前來維持秩序。
西村兼文（京都西本願寺侍臣，當時是尊王攘夷份子，對幕府及新選組採批判立場）在晚年撰寫的《壬生浪士始末記》裡評論這件事，謂京都有所司代，會津藩及其他諸侯亦在當地，竟無法制止這種無法無天的事情發生，幕府衰敗至此實在可憐。
不過平心而論，會津藩沒可能公然處分自己所倚重的浪士組領袖，尤其是政變在即，更不會節外生枝，但放置不管可又不行。待政變過後，市內治安大致穩定之時，便有必要處理內部紀律問題，挽回公眾信心。
松平容保向近藤勇和土方歲三下了一道密令，要他們秘密剷除芹澤鴨和他的黨羽。所謂芹澤鴨的黨羽，即是第二章提到的局長新見錦、助勤野口健司、平山五郎和平間重助。芹澤鴨和新見錦同是局長，在浪士組內有眾多支持者，要如何剷除他們而不使組織陷入混亂，並不是容易的事。
首先遭殃的是局長新見錦，他被殺的經過有幾種說法，但墓地所在不明。在京都中京區壬生寺內，有芹澤鴨和平山五郎的墓碑，在它的右邊，還有一塊墓碑，刻上了田中伊織的名字，死亡日期是九月十三日，一般認為田中伊織就是新見錦的本名。子母澤寬的小說《新撰組始末記》說新見錦之死期在芹澤鴨伏法前十日，即九月六日前後，而為子母澤寬小說提供資料的八木為三郎（浪士組屯所八木家主人八木源之丞的兒子，當時只是小童）則沒有說明新見錦死亡時日，只說不知何時失去蹤影。
據永倉新八《新撰組顛末記》記載，新見錦在九月初因罪切腹，罪名是違背士道和擅自籌措資金（勒索）。而小說家流泉小史的《劍豪秘話》則添加一個故事，謂新見錦在祗園一所叫做「山緒」的料亭設宴款待芹澤鴨和近藤勇等人，席間搭上了芹澤鴨看中的藝妓，讓芹澤鴨懷忙在心，在場的土方歲三乘機在兩人中間挑撥離間，芹澤和新見爆發口角，芹澤乘著酒醉爆出新見錦曾假借自己名義借款的秘密，於是近藤勇當場處死了新見錦。
新見錦雖然名為局長，其實是芹澤鴨提拔用以牽制近藤勇等試衛館派系的一枚棋子，為甚麼是新見錦而不是別人？因為新見錦與芹澤鴨是同鄉，也是神道無念流的同門。三名局長當中芹澤和新見佔了兩席，近藤勇自然孤掌難鳴。然而新見錦死後，芹澤鴨便後悔了，因為一時衝動讓自己失去了可靠的左右手，而這個錯誤也預示了芹澤鴨自身的悲劇。
九月十八日晚，新選組在島原角屋開會兼遊樂。島原角屋便是之前芹澤鴨大肆搗亂的餐廳，似乎那是浪士組（新選組）的御用宴會廳。當晚會議完畢後，各自帶著藝妓返回八木邸繼續歡宴，席間芹澤鴨、平山五郎等人不勝酒力，與藝妓先行進房間休息。近藤勇等人認為這是下手最好時機，於是安排好人手，準備發動襲擊。
當晚，芹澤鴨與愛妾於梅、平山五郎與藝妓吉榮四人睡在離玄關最遠的十疊大的房間，兩對戀人中間隔著一塊屏風；平間重助則和藝妓糸里睡在玄關旁邊的小房間。夜半，近藤勇、土方歲三、沖田總司、山南敬助、原田左之助五人潛入芹澤寢室，一刀把於梅斃命，芹澤鴨驚醒，迅速抄起身旁的短刀砍向距離最近的沖田總司，沖田鼻下受傷，土方歲三加入亂團，最終把芹澤鴨殺死；山南敬助和原田左之助則把屏風後面的平山五郎和吉榮雙雙砍死。平間重助和糸里趁著混亂逃去無蹤，從此下落不明。流泉小史《劍豪秘話》描述平間重助改名諏訪部重助，到各地流浪，最後在岩手縣定居，初時販賣熊膽維生，最後改當農蠶巡迴教師，直到明治二十三年（１８９０年）離世。
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| 新選組屯所選跡（京都八木家宅邸） |
事後新選組給芹澤鴨等人風光大葬，並對外宣稱他們是被長州藩士設計暗殺。由此觸發另一場血腥肅清行動。
原來壬生浪士組成立之初，便有若干長州藩志士混入組織當臥底，暗地裡為尊王攘夷派收集情報。芹澤鴨伏法之後一個星期，九月二十五日，御倉伊勢武（長州出身）、荒木田左馬介（長州出身）、中村金吾（備中出身）和永倉新八四人拜訪公卿大原重德，歸途中順道去祗園一力茶屋遊玩。當晚齋藤一和藤堂平助帶隊前往一力茶屋，要救出永倉新八和殺死御倉伊勢武等人；也許早就察覺到他們是尊攘派間諜，或者收到消息指他們要對永倉新八不利——新選組宣稱長州藩士暗殺芹澤鴨，可能正是揪出長州間諜的策略，引誘間諜們出手——所以動員營救，但永倉新八不願牽連店家，便叫齋藤和藤堂先行離去。
結果御倉伊勢武等人沒有對永倉新八下手，四人一同返回屯所，但御倉伊勢武和荒木田左馬介隨即外出，齋藤一和藤堂平助按照指示，分別跟蹤兩人，在街角暗處施襲，二人當場斃命。同為長州派間諜的越後三郎和松井龍三郎當時外出辦事，聞悉同伴死後不敢再返回屯所。
近藤勇一箭雙鵰，既剷除了芹澤鴨一派，也重創了組織內的間諜活動，從此掌握了整個新選組，成為名符其實的唯一局長。芹澤鴨還有個同伴野口健司，事後仍留在新選組擔任幹部，但在當年十二月二十七日突然被下令切腹，原因不明，終年僅二十一歲。
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