沒有隨同清河八郎回江戶的十三名浪士組成員，留在京都，以壬生村八木源之丞邸和前川莊司邸為屯所，但他們失去領袖人物，不知何去何從。最後他們決定投靠松平容保。三月十三日，松平容保正式收編他們，仍稱作「壬生浪士組」。壬生浪士組十三名成員如下：
芹澤鴨（水戶浪士）
近藤勇（江戶百姓）
土方歲三（江戶百姓）
原田左之助（伊予松山脫藩）
藤堂平助（旗本）
野口健司（水戶脫藩）
新見錦（水戶脫藩）
山南敬助（仙台脫藩）
沖田總司（白河脫藩）
井上源三郎（江戶八王子千人同心）
平山五郎（水戶脫藩）
平間重助（水戶脫藩）
永倉新八（松前脫藩）
這十三人當中，芹澤鴨、野口健司、新見錦、平山五郎和平間重助都是水戶出身，而近藤勇、土方歲三、原田左之助、藤堂平助、山南敬助、沖田總司、井上源三郎和永倉新八都是江戶試衛館的弟子和食客，所以壬生浪士組基本上就是兩個團體的聯合而已。
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| 芹澤鴨 |
芹澤鴨在加入浪士組之前的身世充滿謎團，出生年份便有幾種說法：一說是文政九年（１８２６年），一說是天保元年（１８３０年）——即與清河八郎同齡，也有一說是天保三年（１８３２年），莫衷一是。唯一確定的是他出身水戶芹澤村，是當地鄉士芹澤貞幹的三男，本名叫做芹澤光幹，幼時過繼到當地神官下村家，改名下村繼次。據說曾經到江戶遊學，學習神道無念流劍術，獲得免許皆傳，擔任道場師範代。新見錦、野口健司和平間重助，都是水戶出身，又在神道無念流習劍，是下村繼次的同鄉兼同門，所以關係特別要好。
安政大獄前後，下村繼次捲入了水戶藩內部的鬥爭，他跟隨他的老師武田耕雲齋（水戶藩主德川齊昭時代的執政），在他手下辦事，負責籌措資金實行攘夷；但德川齊昭死後，武田耕雲齋也失勢，過去武田派的不法行為被秋後算帳，下村繼次被捕入獄，後來獲赦，正值清河八郎招募浪士組成員，下村繼次便改名換姓，以芹澤鴨之名，與新見錦、野口健司等同鄉同門一起加入浪士組。
至於近藤勇，他是武藏國多摩郡上石原村的豪農宮川久次郎的三男，原名宮川勝太。他在天保五年（１８３４年）出生，有兩位兄長，長兄音五郎，次兄久米次郎，早逝。父親宮川久次郎雖是豪農，亦好擊劍，他把自宅改建為道場，並邀請天然理心流的近藤周助（也是多摩郡出身）每月三回到自宅教授劍術，小時候的宮川勝太，每天就在自家道場裡練習劍術，直到十八歲才正式拜入近藤周助門下，才七個月就取得天然理心流目錄的位階（天然理心流位階分為六級，由入門始，順序為切紙、目錄、中極位目錄、免許、印可、指南免許），一般人需要兩三年就取得目錄，但宮川勝太只需要七個月，可見天份極高。他因此獲近藤周助賞識並收為養子，從此改稱近藤勇（因近藤周助本姓島崎，所以有一段時間自稱島崎勇）。文久元年（１８６１年）繼承養父的事業，成為天然理心流第四代。
土方歲三武藏國多摩郡石田村出身，比近藤勇小一歲，算是近藤勇半個同鄉。土方歲三是家中孻子，自幼父母雙亡，靠胞姊養育長大。他年輕時曾到江戶市裡的吳服店和木棉問屋當學徒，後來「輟學」，到各地鄉間一邊兜售家傳的「石田散藥」，一邊到不同的道場修習劍術。他的胞姊嫁給多摩郡日野宿名主（村役人）佐藤彥五郎，土方歲三也由此受到佐藤家的照料，而佐藤彥五郎同樣師承天然理心流近藤周助，與近藤勇是結拜兄弟，土方歲三透過姊夫而結識了近藤勇，兩個年紀相若的男兒情投意合，從此一起闖蕩江湖。不論在公在私，土方都是近藤身邊最得力的助手。
沖田總司則是陸奧白河藩足輕沖田勝次郎之子，生於天保十五年（１８４４年）江戶下屋敷。他是家中長子，上有兩位姊姊。他出生後不久父母雙亡，便由兩位姊姊照顧。沖田總司自幼酷愛劍術，大約九歲便進入試衛館跟隨近藤周助習劍，展現極高的天份，很受近藤勇和土方歲三等同門師兄喜愛。沖田總司雖是家中長子，本來可以子承父業，當一個家祿二十二俵二人扶持的足輕，但他志在學武，拒絕繼承家業，逕自脫藩，全心全意當一個習武之人。繼承沖田家業的是他姊夫井上林次郎（入贅沖田家），沖田林次郎後來加入了新徵組，仍與沖田總司保持聯繫。
沖田總司是近藤派中最年輕的伙伴，亦是劍術最高超的一人。他最得意的絕技是三段刺擊，一瞬間連刷三劍，看起來就像一劍，快如閃電，令人防不勝防，同門甚至他門的劍客與他過招，無不心服口服。據文書記載，他十二歲的時候便已跟隨近藤勇外出授徒，近藤勇不便外出的時候，則由沖田總司充當代理師父。他訓練弟子十分嚴格，比起近藤勇更令弟子懼怕；儘管如此，放下武士刀的沖田總司總是展現天真爛漫、平易近人的一面，這也是他受人喜愛的原因之一，近藤勇等人更視他如親弟弟般愛惜。
其他如原田左之助、永倉新八、藤堂平助、山南敬助等人，都是在浪士組結成之前便加入近藤門下。他們都是一流劍客，不過在加入浪士組的時候毫不起眼，直到新選組成立時，便開始活躍。
且說近藤勇等十三人獲松平容保收編為壬生浪士組後，便積極招募志士，擴充團隊，這時候加入壬生浪士組的有齋藤一、山崎烝、谷三十郎、武田觀柳齋等人。壬生浪士組很快有了規模，人多了便需要建立規則監管，於是他們內部自己選舉，挑出組織各部門的負責人：
局長（三名）：芹澤鴨 近藤勇 新見錦
副長（兩名）：山南敬助 土方歲三
助勤：沖田總司 永倉新八 原田左之助 藤堂平助 井上源三郎 野口健司 平山五郎 平間重助 齋藤一 尾形俊太郎 山崎烝 谷三十神 松原忠司 安藤早太郎
調役並監察（三名）：島田魁 川島勝司 林信太郎
勘定役並小荷馱方（四名）：岸田由太郎 尾關彌兵衛 河合耆三郎 酒井兵庫
除了人事安排之外，他們還建立了所謂法度的規矩，約束隊員的行為：
不得違背士道
不得擅自脫隊
不得擅自借錢
不得介入糾紛
不得私鬥
違背以上任何一項者切腹
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